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肿瘤侵袭轉移是恶性肿瘤致死的主要原因，而細胞骨架動態重構(gou)是肿瘤細胞获得遷移侵袭能(neng)力的關键。肌動蛋白（Actin）作為細胞骨(gu)架核心成分，其單體G-actin與聚合態F-actin的動態平(ping)衡直接決(jue)定細胞運動能力。液(ye)液相分离（LLPS）是調控蛋白功能的重要(yao)機製(zhi)，但(dan)其與肌動蛋白動態轉换(huan)、肿瘤侵袭的關(guan)系尚不明確，且目前缺乏精準靶向G/F-actin平衡的手段，成為肿瘤靶向(xiang)治疗的重要瓶颈。
近日，天津大學聯合天津医科大學(xue)生物医學工程與技術學院賀慧宁(ning)院长研究團隊在化學领域的顶級期刊《Journal of the American Chemical Society》（JACS，IF=15.7）上发表題(ti)為“Hijacking Actin-Pre-Liquid-Liquid Phase Separation Suppresses Malignant Tumor Invasion and Growth”的研究论(lun)文。该研究首次揭(jie)示了肌動蛋白（Actin）在細胞内的预液液相分离（Pre-LLPS）機製，並基(ji)於此開发了一種新型四臂(bi)交聯分子4Arm-Pen，通(tong)過靶向G-actin液滴實現對(dui)肿瘤細胞遷移和(he)侵袭的有效抑製。
北京青莲(lian)百奥在本研(yan)究中提供了蛋白質組學技術支持，助力解析4Arm-Pen在細胞内的交聯蛋(dan)白靶點谱。
樣本信息
細胞樣本：小鼠結肠癌細(xi)胞CT-26、小鼠胚胎成纖(xian)維細胞NIH-3T3，構(gou)建eGFP-actin標記稳轉(zhuan)細(xi)胞株；
組織樣本：BALB/c小鼠皮下肿瘤組(zu)織、血管旁(pang)肿瘤組織；
體外樣本：純化兔肌(ji)動蛋白(bai)、體(ti)外重構相分离體系樣本。
實驗技術
類別 |
技術方法 |
| 力學與成像檢測 | 納米壓痕(hen)技術(shu)、激光共(gong)聚焦延時成像、FRAP荧光漂白恢复(fu)實驗 |
| 體外相分离重構 | PEG/DEX雙水相體系誘导LLPS |
| 交聯蛋白檢測 | 生物素標記(ji)4Arm-Pen交聯蛋白質(zhi)組學、靶向(xiang)蛋白(bai)質定量組學 |
| 分子與細胞功能檢測 | Western Blot、G/F-action分离、基(ji)因突變構建；劃痕愈合、侵袭共培(pei)养、全(quan)息細胞成像 |
| 数理模擬分析 | CytoSIM細胞(bao)骨架模擬、肌動蛋白聚合動力學建模 |
研究亮點速遞
1.機製首创：首(shou)次发現並定(ding)義Actin-Pre-LLPS，明確其作為G-actin储存池調控肿瘤細胞運動的全新機製。
2.靶向精準：研发(fa)4Arm-Pen分子(zi)，特异性靶向肌動(dong)蛋白(bai)Cys374位點，正交(jiao)二硫键交聯不干扰正常細胞功能。
3.效果顯著：通過逆轉Actin-Pre-LLPS，阻断G-actin活化與F-actin聚合，強(qiang)效(xiao)抑製肿瘤細胞侵袭、遷移與增(zeng)殖。
4.技術支撐：通過蛋白質組學技術精(jing)準锁定靶(ba)向蛋白，驗證(zheng)分子(zi)作用特异性，為成果提(ti)供硬核数據支撐(cheng)。
研究結果
1、“储存型”肌動蛋白在細胞片状伪(wei)足附近產生液-液相分离
研究方法：構建小鼠皮下肿瘤模型，通過H&E染色、納米(mi)壓痕技術檢測血管旁（PV）與肿瘤實體（IT）組織(zhi)細胞密度與有效杨氏模量；構(gou)建eGFP-actin標(biao)記細胞株，激光共聚焦觀測肌動蛋白聚集状態，關(guan)聯(lian)細胞運動能力。
研究結果：高侵袭性血管旁肿瘤組織細胞(bao)密(mi)度顯著高於肿瘤内部，且組織剛度更(geng)低（杨氏模量＜50kPa）；高遷(qian)移肿瘤細胞伪足區域出現(xian)高浓度肌動蛋白聚集區，形成動(dong)態液滴結構，首次證實(shi)Actin-Pre-LLPS現象，切该(gai)現象與肿瘤細胞(bao)遷移表型密切相關。
圖1 肿瘤細胞簇通過肌動蛋(dan)白Pre-LLPS改變細胞(bao)剛性實現表型轉换(huan)
2、Actin-Pre-LLPS是調控(kong)細(xi)胞運動的“調(diao)度”策略
研究方法：純化(hua)G-actin並體外誘(you)导相分离，結合延(yan)時成(cheng)像、FRAP實驗驗證液滴流動性；雙(shuang)相富集分离不同(tong)状態肌動蛋白，透射(she)電镜觀察蛋白形(xing)態。
研究結果：體外成(cheng)功重構Actin-Pre-LLPS體系，在活細胞及體(ti)外體(ti)系中均觀察到動態、可融(rong)合的肌動蛋白(bai)液滴，该過程具(ju)有浓度依赖性和可逆性（1,6-己二醇可消除(chu)液滴），且液滴内分子具備快速遷(qian)移能(neng)力（圖2）。首次證實存在储存型G-actin與活化型G-actin兩(liang)種(zhong)状態，储存型G-actin存在於相分离液(ye)滴中(zhong)，不自发聚合，但在ATP浓度升高時可被激活並組裝成(cheng)F-肌動蛋白。證實Actin-Pre-LLPS液滴為肌動蛋白储存池，可按需為細胞運動提供骨(gu)架原(yuan)料（圖3）。
圖2 储存型G-肌動蛋白誘导(dao)Pre-LLPS並形成非聚合活性(xing)液(ye)滴
圖3 Actin-Pre-LLPS遵循LLPS規則，調控細胞運動和F-肌動蛋白的形成
3、蛋白質組學揭示Pre-LLPS形成的肌動蛋白液(ye)滴可作為4Arm-Pen的(de)靶(ba)點
研究方法：基於半胱氨酸正交二硫键化學原理，設計合成靶向分子4Arm-Pen，構(gou)建C374A突變體(ti)驗證(zheng)作用靶點；構建肌動(dong)蛋(dan)白C374A突變細胞(bao)株，結合荧光共定(ding)位成像、生物素標記(ji)4Arm-Pen交聯蛋白質(zhi)組學技術(shu)（青莲百奥提供蛋白質組學分析），驗證分(fen)子靶向特异性(xing)與精準作用位點。
研究結果：成功(gong)合成高純度(du)靶向分子4Arm-Pen，分子結構與(yu)理化性質符合后續實驗(yan)要求（圖4）。该分子可特异(yi)性結(jie)合肌動蛋白Cys374位點，C374A突變可完(wan)全阻断二者結合作用(yong)，荧光共定位顯示其(qi)可精準富集於伪足相分离液(ye)滴區域（圖5）；交聯蛋白質組(zu)學数據證(zheng)實，4Arm-Pen仅優先靶向(xiang)結合肌動蛋(dan)白，无明顯非特异性結合，靶點專一性極強。
圖4 4Arm-PEG-Pen可以针對肌(ji)動蛋白液滴形成交聯(lian)效應
圖5 4Arm-Pen能清(qing)除肌(ji)動蛋白液滴，並偏好細胞(bao)内肌動蛋白交聯(lian)
4、4Arm-Pen顯著改變細胞骨架聚合動力學
研究方法：透(tou)射電(dian)镜觀察4Arm-Pen處理后G-actin聚合形態；G/F-actin分离試剂盒(he)檢測單體與聚合態肌動蛋白比例；構(gou)建Actin-Pre-LLPS、正(zheng)常聚合、4Arm-Pen干预三種模型，通過数(shu)學建模與CytoSIM模擬分析聚合動(dong)力學。
研究結果：4Arm-Pen處理后，G-actin形成四聚體或无序聚集體，无法正常聚合成F-actin丝；胞内储存型G-actin大量消耗，G/F-actin比值顯著(zhu)降低，正常微丝結構(gou)重構受(shou)阻；数學建模與模擬(ni)證實，4Arm-Pen改變肌動蛋白聚合動力學常数，阻断活(huo)化型G-actin生成(cheng)，將肌動蛋白锁(suo)定為(wei)非功能性四聚體，而非(fei)傳統微丝稳定(ding)剂。以上結果表明(ming)，4Arm-Pen通過交(jiao)聯G-actin改變其聚合動力學，阻止F-actin的正常形成。
圖6 4Arm-Pen通過(guo)修(xiu)飾G-actin影響肌動蛋白聚合動力學
5、4Arm-Pen介(jie)导G-actin耗竭，強效抑製肿(zhong)瘤細(xi)胞遷移與侵袭
研究方法：細胞劃痕實驗、全息細胞成像檢測細胞遷(qian)移(yi)速率與運動轨迹；肿瘤細胞與成纖維細胞(bao)共培养侵袭實驗，檢(jian)測肿瘤侵袭能力；建立CT-26與NIH-3T3共培养侵袭模型評估細(xi)胞侵袭能力(li)，並構建C374A突變細胞株(zhu)驗證(zheng)靶點特异性。
研究結果：4Arm-Pen處理后，CT-26肿瘤(liu)細胞24h遷移距(ju)离及(ji)細胞運動速度均顯著下降；肿瘤細胞(bao)侵袭NIH-3T3成纖維細胞單層的能(neng)力和侵袭速率顯著下降；游离半胱氨酸可竞争性逆轉4Arm-Pen的抑製作用，C374A突變肿(zhong)瘤細胞完(wan)全耐受该分子，進一步證(zheng)實其作用靶點為肌動蛋白(bai)Cys374，且對正(zheng)常成纖維細胞无明顯影響(xiang)，選擇性優异。以上結果表明(ming)，4Arm-Pen通(tong)過靶向G-actin Cys374位點，特异性抑製肿瘤細胞的(de)遷(qian)移與侵袭。
圖7 4Arm-Pen通過介导G-actin耗竭抑製肿瘤細胞遷(qian)移與侵袭的功能驗證(zheng)
6、4Arm-Pen可抑製恶性肿瘤侵袭與生长
研究方法：建立CT-26皮下荷(he)瘤小鼠模(mo)型，進行瘤(liu)内注射4Arm-Pen（5 mg/kg），监測肿瘤體积、小鼠體(ti)重及生存(cun)期，組織納米壓痕技術測定肿瘤硬度，H&E染(ran)色評(ping)估肿瘤及主要器官的病理變化。
研究結果：4Arm-Pen處理組肿瘤(liu)生长顯著受抑，生存期(qi)延长，各組小鼠體重无顯著差异，表明药物耐受性良好；4Arm-Pen處理組肿瘤組(zu)織硬度顯著增(zeng)加，力-位移曲線发生改變；H&E染色顯示肿(zhong)瘤組織坏死區域增加，而主(zhu)要(yao)器官（心、肝、脾、肺、肾）未见明顯损伤。研究提出(chu)4Arm-Pen可能通過(guo)改變(bian)肿瘤力學微環境間接抑製肿瘤進展，表(biao)明(ming)4Arm-Pen體内(nei)應用安全有效，通(tong)過靶向Actin-Pre-LLPS抑製肿瘤生长並改變組織力學特(te)性。
圖8 4Arm-Pen可抑製恶性肿瘤侵袭與生长
研究結论
本研究首次突(tu)破性揭示(shi)了Actin-Pre-LLPS作為肌動(dong)蛋白储存池調(diao)控肿瘤細胞侵袭、遷移的(de)核心機製，明確了该(gai)過程是(shi)恶性肿瘤获得高侵袭性的關键環節。團(tuan)隊基於正交二硫键化(hua)學成功研发的靶向分子(zi)4Arm-Pen，可特(te)异性結合肌動蛋(dan)白Cys374位點，逆轉Actin-Pre-LLPS過程，耗竭胞内储存型G-actin，阻断F-actin正(zheng)常聚合，最終強效抑製肿瘤細胞的(de)侵袭、遷(qian)移與增殖能(neng)力。
參考文献與全文鏈接
[1] Zhang Z, Yin K, Li B, et al. Hijacking Actin-Pre-Liquid-Liquid Phase Separation Suppresses Malignant Tumor Invasion and Growth. J Am Chem Soc. 2026 Mar 7. doi: 10.1021/jacs.5c19435.
青莲百奥合作文章
青莲百奥深度參與(yu)衆多前沿(yan)研究，與中國医學(xue)科學院、中國科學院、军事医學研究(jiu)院、國家蛋(dan)白質科學中心、四川大學華西医院(yuan)等顶尖科研機構通(tong)力合作，累計发(fa)表SCI论文近200篇，累計影響因子(zi)（IF）超1500。多項重磅研究成果发表(biao)於(yu)《Nature》《Science Translational Medicine》《Nature Communications》等國际顶級期刊。
