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非小細胞肺(fei)癌（NSCLC）細胞的积累(lei)和增殖高度依赖谷氨酰(xian)胺，阻断谷氨酰胺代谢有潜力成為治疗非小(xiao)細(xi)胞肺癌的臨床策略。其中ASCT2介导氨基酸底物(wu)的交(jiao)换，並负(fu)責谷(gu)氨酰胺的轉運，异常的ASCT2表達被認為(wei)與高(gao)度增殖的癌細胞有關，以满(man)足增強的(de)谷氨酰胺需求，且與侵袭性表型和不良(liang)预后相(xiang)關，因(yin)此肿(zhong)瘤中對ASCT2的成瘾成為致(zhi)癌過程中的(de)重要靶點。而棕(zong)榈酰化修飾被認為在多種代谢過程中起着關键(jian)作用，並與癌症中的膜定位、亚細胞運輸和蛋白質降解等調控密(mi)切(qie)相關，但其在谷氨酰胺代谢中的作用(yong)仍不(bu)明確。
近日，宁波大學第一附屬医院曹超副院长團隊(dui)在Cell Discovery（IF 12.5）发(fa)表(biao)了題為“ASCT2 palmitoylation regulated by JNK1-ZDHHC14 axisorchestrates glutamine metabolism and NSCLC progression”的研究论文，该研究中作者基於(yu)非小細胞肺癌細胞系進行了蛋(dan)白質組學檢測，以分析谷氨(an)酰胺代谢調控因子的棕(zong)榈酰化。文章揭示了JNK介导的ASCT2棕榈酰化與(yu)谷氨酰胺代谢之間存在磷(lin)酸化-棕榈酰化轴，為非小細胞肺癌提(ti)供了潜在的治疗策略。
北京(jing)青莲百奥生物科技有限公(gong)司為文章提供了蛋白質組學服務。
研究結果
一、ZDHHC14促進ASCT2棕榈(lv)酰化和溶酶體(ti)降解
為了研究棕榈酰化調節谷氨酰胺(an)代谢的(de)多重調控機製，文章使用棕榈酰化抑(yi)製剂(ji)2-溴(xiu)棕榈酰胺（2-BP）處(chu)理NSCLC細胞，发現其可顯著增強了谷氨酰胺的摄取和谷氨酸產(chan)生，且具(ju)有剂量依(yi)赖性。随后的棕榈酰化蛋白質組學(xue)分(fen)析，发現ASCT2可能被棕榈酰(xian)化。進一步(bu)實驗的結果證實，2-BP抑製的棕榈酰化以時間依赖性方式增(zeng)加(jia)了ASCT2的蛋白(bai)表(biao)達但mRNA表達未(wei)增加(jia)，表明2-BP調控(kong)ASCT2在棕榈酰化(hua)水平的表(biao)達，修飾(shi)位點為半胱氨酸。这些发現表明ASCT2棕榈(lv)酰化會(hui)使NSCLC中的(de)ASCT2蛋白不稳定。
圖1. ZDHHC14促進ASCT2棕榈(lv)酰化和溶酶體(ti)降解
為了(le)筛選(xuan)负責ASCT2棕榈酰化(hua)的棕榈酰轉移酶(mei)，研(yan)究(jiu)轉染了一系列编碼ZDHHC家(jia)族成員(yuan)的質粒，並(bing)通過免疫共沉淀（Co-IP）分析其與ASCT2的(de)相(xiang)互作用。結(jie)果锁定了ZDHHC14，且该蛋白以(yi)剂量依赖性的方式增強(qiang)了棕榈酰化信號。為進(jin)一步確定(ding)ZDHHC14催化棕榈酰化對(dui)ASCT2的(de)影響，通過分析野生型ZDHHC14、催化不活性ZDHHC14突(tu)變細胞或ZDHHC14敲除細胞中(zhong)的ASCT2蛋白稳定性，发現ASCT2降(jiang)解受ZDHHC14調控(kong)。因此，这些数據體(ti)現了ASCT2與ZDHHC14之間的(de)酶-底物關系及棕榈酰化修飾(shi)的重要性。
接下(xia)來，研究使用溶酶(mei)體抑製剂BafA1和蛋(dan)白酶(mei)抑製剂MG132處(chu)理ZDHHC14過表(biao)達細胞，以確認ZDHHC14介导ASCT2降解機(ji)製。发現ZDHHC14介导的ASCT2降解被(bei)BafA1阻(zu)断(duan)，而MG132處理則不然，表明棕榈酰化介导的ASCT2降解主要由(you)溶酶體降(jiang)解途径調控。免疫荧光也顯示ZDHHC14過(guo)表達促進了(le)ASCT2細胞質定位，並增加了ASCT2與溶酶體膜蛋白LAMP1的共定位(wei)。
二、ASCT2在Cys39和Cys48位(wei)點被ZDHHC14棕(zong)榈酰化
文章基於LC-MS/MS研究結果，進一步通過氨基酸突變+點擊化學實驗(yan)測試棕榈酰化的(de)半胱氨酸位點，得出ASCT2C39S以及ASCT2C48S突變體均顯著(zhu)减少了(le)ASCT2棕(zong)榈酰化，表(biao)明这兩個位點對ASCT2棕榈酰化(hua)至關重要。此外，外源(yuan)性ZDHHC14表(biao)達能顯著促進WT中ASCT2表達的(de)棕榈酰化水平，但對ASCT2C39S/C48S突變體(ti)則无此作用，也說明了(le)ZDHHC14特异性介导Cys39和Cys48位(wei)點的ASCT2棕(zong)榈酰化。
為了分析Cys39和Cys48位點對ASCT2降解的影響，研究用蛋白質(zhi)合成抑製剂(ji)CHX分別處理表達(da)野生(sheng)型ASCT2以(yi)及(ji)單突變體、雙(shuang)突變體的(de)細胞，发現與WT ASCT2相(xiang)比，ASCT2棕榈酰化(hua)突變體(ti)細胞的半衰期顯著延长，这與2-BP處理(li)的(de)效果相似。免疫荧光分析(xi)顯(xian)示，ASCT2C39S/C48S突變體顯著降低了(le)其與LAMP1阳性溶酶體簇(cu)的共(gong)定。由此表明，ASCT2的Cys39和Cys48棕(zong)榈酰化(hua)位點主要參與其溶酶體介导的蛋白質降解過程。
圖2. ASCT2棕榈酰化的Cys39和Cys48位點主要參與溶(rong)酶體介导的蛋白質降解
三、ABHD17B去(qu)棕榈酰化ASCT2並促進(jin)ASCT2稳定
為了鉴定ASCT2的潜在去棕榈酰化酶(mei)，文章過表(biao)達了一系列(lie)已知的去棕榈酰化酶，並(bing)通過免疫共沉淀實(shi)驗進行檢測，結果顯示仅(jin)ABHD17B與ASCT2存在強相互作(zuo)用，驗證发現外源性ABHD17B的表達可顯著降低ASCT2的棕榈酰化水平。随后文章(zhang)構建了ABHD17B敲低和過表(biao)達的細胞系(xi)，发現敲(qiao)低ABHD17B可导致ASCT2蛋白水(shui)平(ping)顯著下調，而過表(biao)達則使其蛋白水平顯著升高。使用ABHD17B的共价抑(yi)製剂(ji)ABD957處(chu)理細胞，可引(yin)起ASCT2蛋白水平呈時間依赖性下降。此外，外源(yuan)性ABHD17B表達抑製了ASCT2的(de)降解，从(cong)而有效促進其蛋白累积，而(er)在敲低ABHD17B表達的(de)細胞(bao)中，溶酶體(ti)抑製剂BafA1而非蛋白酶體抑製剂MG132處(chu)理阻断了ASCT2的(de)降解。免疫荧光分析也表明，ABHD17B的表達降低了ASCT2與溶酶體的共定位。研究還发現ABHD17B與ASCT2並不在質膜上共(gong)定位。
為了深入探究ASCT2棕榈酰化状態改變(bian)的潜(qian)在機製，研究進行(xing)了免疫沉淀-質谱分析，通過IP-MS比(bi)较了ASCT2C39S/C48S突變體(ti)與野生(sheng)型ASCT2的互作蛋白，結果中(zhong)突變體結合增強的前八位候選蛋白均屬於依赖逆(ni)運复合體（Retromer）的内體循環組分。其中TRIM27在非小(xiao)細胞肺(fei)癌中顯著高表達，且(qie)與患(huan)者不良生存密切相關，被選擇作為研(yan)究(jiu)對象以阐明ACT2棕榈酰化(hua)的調控(kong)機製。通過CoIP檢測发現，ASCT2C39S/C48S突變體中，ASCT2與TRIM27的結合增強，而敲低TRIM27表達能顯著降低了ABHD17B介导的ASCT2累积。綜上所(suo)述，ABHD17B介导的ASCT2去棕榈酰化通過增強ASCT2依赖逆運复合體的内體循環過程(cheng)发(fa)挥作用。
圖3. ABHD17B去(qu)棕榈酰化ASCT2並促進(jin)ASCT2稳定
四、谷氨酰胺(an)剥夺通過調控(kong)ZDHHC14稳定性抑(yi)製ASCT2棕(zong)榈酰化
先前研究(jiu)表(biao)明，谷(gu)氨酰胺剥夺条(tiao)件下ASCT2表達上(shang)調(diao)，但这一應(ying)激(ji)条件下棕榈酰化修飾對ASCT2稳(wen)定性的影響尚不明確。本文发現，在細胞中谷氨酰胺剥(bo)夺顯著增加(jia)了ASCT2的蛋白(bai)水平，同時降低了ASCT2的棕榈酰化信號。而在ASCT2 C39S/C48S突變體細胞中，ASCT2的棕(zong)榈酰化水(shui)平无顯著差异。為了進一步(bu)討论谷(gu)氨酰胺剥夺在ASCT2棕榈酰化(hua)中的作用及(ji)機製，研究发現ZDHHC14的蛋白(bai)水平降低，同時ASCT2與ABHD17B的相互(hu)作(zuo)用减弱，表明仅棕榈酰化的ASCT2能與ABHD17B結合，谷氨(an)酰(xian)胺剥夺以時間依赖性方式促進ZDHHC14的(de)降解。上述結(jie)果說明，谷氨(an)酰胺剥夺通(tong)過降低ZDHHC14的稳(wen)定(ding)性，从(cong)而(er)抑製ASCT2的棕榈酰化。
谷氨(an)酰胺剥夺导致(zhi)的營养胁迫會激活p38-MAPK、Akt-mTOR、ERK和JNK等信號(hao)通路，文章通過在谷氨酰胺剥夺条件下聯合使用这些(xie)信號通路抑(yi)製剂，檢測了ZDHHC14和ASCT2的蛋白(bai)水平。結果顯示仅(jin)JNK抑製剂處理不仅提升了ZDHHC14的水平，還降低了(le)ASCT2的水平。此外，JNK激動剂聯(lian)合BafA1和MG132和(he)卡非佐米可恢复ZDHHC14的水平，这表明JNK介导的ZDHHC14降解(jie)主要通過溶(rong)酶體降解途径調控，激動(dong)剂處理顯(xian)著上調ASCT2水(shui)平(ping)，同(tong)時呈剂量依赖性地降(jiang)低ZDHHC14水(shui)平(ping)。點擊化學(xue)也表明JNK激動剂顯著抑製ASCT2的棕榈酰化，而JNK抑(yi)製剂(ji)在谷氨酰胺剥夺条件下則顯著增強ASCT2的棕榈酰化。因此，这(zhe)些数據強調了JNK通路是(shi)谷氨酰胺剥夺条件下調控(kong)ZDHHC14介导的ASCT2棕(zong)榈酰化的主要信號通路(lu)。
圖4. 谷氨酰胺(an)剥夺(duo)通過JNK途径抑(yi)製ASCT2棕(zong)榈酰化
五、ZDHHC14在谷氨酰胺剥夺刺(ci)激下被JNK1磷酸(suan)化
接下(xia)來，研究探索了(le)JNK調控(kong)ZDHHC14介导的ASCT2棕榈酰化的具體機(ji)製。首先CoIP分析檢測了(le)ZDHHC14與JNK各亚型(xing)之間的相互作用，結果顯示仅(jin)JNK1能與ZDHHC14形成(cheng)复合物。而將JNK1敲低表達，並在含或(huo)不含谷氨酰胺的培(pei)养基中培养发現，ZDHHC14的表達顯著提(ti)升，同時抑製了ASCT2的水平。抑製JNK1磷酸化與激活在谷氨酰胺剥夺(duo)条件下也能引起ZDHHC14的积累，並降(jiang)低了ASCT2的水平。
為了鉴定響(xiang)應谷氨酰胺剥夺刺激而发生的(de)ZDHHC14磷酸化(hua)位點，研(yan)究建通過LC-MS/MS分(fen)析(xi)发現了ZDHHC14的三(san)個(ge)磷酸化位點：Thr124、Thr440和Ser455。點突變(bian)實驗发現，仅ZDHHC14 T440A突變體在谷氨酰胺剥夺条(tiao)件下能顯(xian)著挽救ZDHHC14蛋(dan)白水平的下降，表明Thr440位點對ZDHHC14蛋白稳定性至關重要。而在谷氨酰胺剥夺条件下，ZDHHC14 T440A以時間依赖(lai)性方式延长(zhang)了ZDHHC14蛋白的(de)半衰期，而野生(sheng)型能(neng)顯著調控ZDHHC14和ASCT2的稳定性以及ZDHHC14的磷酸化(hua)，且这種調(diao)控效應能(neng)被JNK抑(yi)製剂(ji)強烈抑製。綜上所(suo)述，谷氨酰胺剥夺時(shi)JNK1被激活，進而(er)磷酸化ZDHHC14的Thr440残基，触发ZDHHC14降解，从(cong)而(er)抑製ASCT2的棕榈酰化修飾，並最終导致ASCT2积累。
圖5. JNK1介导的磷(lin)酸化通過触发ZDHHC14降解稳定(ding)ASCT2
六、ZDHHC14介导的ASCT2棕榈酰化調控(kong)谷氨酰胺(an)代谢和肿瘤发生
文章進(jin)一步探索了ZDHHC14在谷氨酰胺代谢中扮演的角色，通(tong)過分析檢測肿瘤細胞的體(ti)外增殖能力，发現ZDHHC14顯(xian)著抑製了肿瘤細胞生长和(he)集落形成，而將其(qi)催化失活的突變體仅產(chan)生轻微影響，在體内异種(zhong)移植瘤實驗也得到了類似結果。動物實驗发現，與野生型相比，表達ASCT2 C39S/C48S突變體(ti)的細胞顯示出顯著增強的(de)肿瘤生长能力，且ZDHHC14的表達(da)仅(jin)在野生型ASCT2表達組(zu)中抑製了肿瘤生(sheng)长，而在(zai)突變體(ti)表達組中无此抑製作用。
随后研究討(tao)论了(le)ZDHHC14與ASCT2的表達水平與臨床数據集中(zhong)患者(zhe)的生存期存在相關性。與正(zheng)常組織相比(bi)，NSCLC組織中ZDHHC14的mRNA水平顯(xian)著降低(di)，ZDHHC14低表達(da)的NSCLC患者生存期更短，ASCT2的高表達與(yu)NSCLC密切相關並预(yu)示不良(liang)的总生存期，IHC染色也進一步證(zheng)實ASCT2與ZDHHC14的表達(da)呈负相關。因此，ASCT2的高表達與(yu)ZDHHC14的表達(da)呈负相關，並對NSCLC的(de)臨床(chuang)進展至關重要。
圖6. ZDHHC14-ASCT2轴調(diao)控非小細胞肺癌中的谷氨酰胺(an)代谢和肿瘤发生
七、靶向(xiang)JNK通路可促進ASCT2抑製剂(ji)的抗癌效果
先前(qian)研究发現(xian)，使用V9302對ASCT2進行药理阻断可削弱癌細胞(bao)的生长(zhang)與增殖。因此研究進一步討论(lun)靶向(xiang)JNK通路可能與抗ASCT2治(zhi)疗產生协同增效作用。文章发現，JNK激動剂(ji)在内源(yuan)性表達野生型ASCT2的細胞中顯著促(cu)進了谷氨酰胺代谢(xie)，但在表達ASCT2 C39S/C48S突(tu)變體的細胞中(zhong)无此效應，这進一(yi)步(bu)證實JNK1通過調控(kong)ASCT2棕榈酰化影響(xiang)谷氨(an)酰胺代谢。
為(wei)評估这些抑製(zhi)剂在體内的抗肿瘤效果，研究(jiu)動物實驗，分別評估單独(du)使用JNK-抑製剂(ji)、V9302以及兩药聯合治疗(liao)對肿(zhong)瘤的疗效。結果(guo)发現JNK抑(yi)製剂(ji)與ASCT2抑製剂聯合用药組的抗肿瘤(liu)效果優於任一單药治(zhi)疗組，IHC染色(se)分析也進(jin)一步證實了ASCT2、磷酸(suan)化JNK與ZDHHC14之間的強關聯(lian)。說明靶向(xiang)JNK與ASCT2的雙(shuang)重药物治疗在(zai)體内外均可协同抑製肿瘤发生，為非小細胞肺癌的臨床治疗提(ti)供了一種合理的聯合用药策略(lve)。
圖7. ASCT2抑(yi)製剂(ji)與JNKi聯合(he)在NSCLC中的协同抗癌活性
文章結论
本(ben)文揭示了一種新的磷(lin)酸化-棕榈酰化(hua)級聯反應(ying)，將營养感知與(yu)非小細胞肺癌中的谷氨酰胺運輸聯系起來。文章(zhang)展示了JNK1介导的ZDHHC14磷(lin)酸化如何調控ASCT2棕榈酰化(hua)和稳定性，揭示了代谢適應(ying)機製(zhi)。这些发(fa)現確立了棕榈酰化作為癌症代谢中的關键調(diao)控節點，並(bing)強調了JNK1-ZDHHC14-ASCT2轴作為潜在治疗靶點(dian)。
參考文献
Chen X, Ke Z, Wei S, Chen J, Zhu K, Xu J, Zhao Y, Cen M, Jin Y, Pan Z, Xiong J, Chen Y, Dong C, Cao Q, Cao C. ASCT2 palmitoylation regulated by JNK1-ZDHHC14 axis orchestrates glutamine metabolism and NSCLC progression. Cell Discov. 2026 Feb 24;12(1):13.
青莲百奥合作文章
青莲百奥深度參與衆多前沿研(yan)究(jiu)，與中國医學科學院、中國(guo)科學院、军事医學(xue)研(yan)究院、國家蛋白質科學中心、四川大學華西医院等顶(ding)尖科研機構(gou)通力合作，累計发表SCI论文近(jin)200篇，累計影響因子（IF）超1500。多項重磅(bang)研究成果发表於(yu)《Nature》《Science Translational Medicine》《Nature Communications》等國际顶級期刊(kan)。
