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顶(ding)复門寄生虫（如弓(gong)形虫(chong)、疟原虫）作為專性細胞内寄生物，通過入侵宿主細胞並在其内部生存繁殖，引发弓形(xing)虫病(bing)、疟疾等嚴重感染性疾病，因(yin)其對宿主細胞的依赖性掠夺而(er)被称為"細胞吸血鬼(gui)"。这類寄生原虫在长期演化適應過程中，其(qi)線粒體基因組經历了極(ji)度的紧凑化，目前仅保留了3個蛋白编碼(ma)基因（cox1、cox3和cob），而(er)線粒體rRNA則(ze)碎裂成多個零散片段(duan)，呈現出(chu)高度的(de)片段化状態。
2024年12月17日，中國農業大學與首都医科大學附屬北京友誼医院北京熱带医(yi)學研究所(suo)、瑞士日内瓦大學和法國波爾多大學的(de)研究團隊開展國际合作，在《Nature Communications》期刊（影(ying)響因(yin)子IF：14.7）上发表了一(yi)項重磅研究，題目為"Apicomplexan mitoribosome from highly fragmented rRNAs to a functional machine"。这項(xiang)研究綜(zong)合運用CRISPR/Cas9基(ji)因编輯技術、轉錄組(zu)學、蛋白(bai)組學以及冷冻(dong)電镜結構解析等多個學科的研究方法和手段，首次系統揭示了(le)顶复門原虫（剛地弓形虫）線粒體核糖體的深層結(jie)構原理和(he)組裝機製，阐明了高度碎片化核糖體RNA如(ru)何在衆多蛋白因子的协助下構建成功能完(wan)整的核糖體复合體。研究團隊同步鉴(jian)定出四個具有AP2結構域(yu)的蛋白質，这些蛋白質在維持虫體線(xian)粒體核糖體的結(jie)構完整性和生物學功能中发挥着關键的調控作用。该(gai)項研究的(de)发現為针對弓形虫和疟原虫等寄生虫類疾病的新型治疗策略開发奠定了分子基礎，提供(gong)了新的(de)、具有(you)潜力(li)的分子靶點，有望推動相關药物設(she)計和臨床干预手段的创新(xin)发展。
青莲百奥為该研究提供了(le)定量蛋白組學(xue)分析服務。
本研究所關注的寄生原虫類病原體主要包括兩個顶复門原虫的典型代表物種：其一是弓(gong)形虫（Toxoplasma gondii），这是一種人畜共患(huan)的單細(xi)胞寄生原虫，具有廣泛的宿主範围和重
關键樣本：条(tiao)件性敲低（conditional knockdown）四個線粒體AP2蛋(dan)白（mtAP2-1至mtAP2-4）的轉(zhuan)基因虫株
CRISPR/Cas9基因(yin)编輯技術用於精準修改靶向(xiang)DNA序列，在遗傳疾(ji)病模型(xing)構建和功能驗證中发挥核心作用；轉(zhuan)錄組測序(xu)技術（RNA-seq）能够全面檢測細胞或組織中的基因表達谱(pu)；免疫(yi)共沉淀（IP）和質谱分析（MS）聯合應用可识別蛋白質相互作用網絡；定量蛋白(bai)組學通過液相色谱-質谱聯用（LC
AP2/ERF家族蛋白在不同生物體系中展現出多元化的分子功能。该(gai)蛋白家族在植物和顶复門原虫中傳統上作為轉錄調控因子发挥(hui)基因表達調控作用，但研究发現其在顶复門原虫線粒體内部展現出完(wan)全不同的生物學角色(se)，轉變為參與線粒體核糖體大小亚(ya)基的蛋白質(zhi)組分，直(zhi)接參與核糖體的(de)組裝過程。
高度碎片化的線粒體rRNA組裝機製研究揭示了弓形虫这(zhe)一重要病原體的独特生(sheng)物學特征：该(gai)寄生虫利用(yong)40多個mt-rRNA片段和(he)122個核编碼(ma)線粒體核糖體蛋白的精準(zhun)协作，完成了(le)完整功能核糖體的組(zu)裝
独特線粒(li)體核糖體結構：通過單(dan)顆粒冷冻電镜技術，首次(ci)解析了顶(ding)复門原虫代表-弓(gong)形虫線粒(li)體核糖體的高分辨率三維結構，為目(mu)前已報道的核糖體和線粒體核糖體中結構最為复雜的核(he)糖體。
本研究通過生物信息學分析方(fang)法在顶复門原虫这一重要病原微生物類(lei)群中鉴定出四個具有AP2結構域(yu)的蛋白（mtAP2-1至mtAP2-4），这些蛋(dan)白在不同顶复虫物種間表現出(chu)高度的序列保守性，提示其具有重要的生物學功能。研(yan)究采用(yong)CRISPR/Cas9基因编輯技術對目(mu)的基因進(jin)行精確修飾，結合免疫荧光實驗（IFA）和Split-GFP互补檢(jian)測技術，確認了这四個mtAP2蛋白均定位於弓(gong)形虫線粒體基質这一關键細胞器内。通過条件性敲低實驗系(xi)統地探索蛋白功(gong)能，結果表明mtAP2蛋白(bai)的缺失會导致寄生虫細胞(bao)增殖速率顯著下降，直接影響其(qi)复製能力。该(gai)生长缺陷表(biao)型可通過导入野生型基因進行回补，生长能力得到完全恢复，證實了觀(guan)察到的表型來自於目的(de)基因的缺失。
圖1 四個具有AP2功能域的蛋白在顶(ding)复門中高度保守。这四個蛋白定位於弓形虫(chong)的線粒體基(ji)質中，其與虫體胞内增殖和對小鼠致(zhi)病性相(xiang)關。
通過RNA-seq分析发現，mtAP2蛋白的缺失並(bing)未顯著影響虫體乃至線粒體内轉(zhuan)錄水平，表明其不作為(wei)轉錄(lu)因子发挥作用，而是通過其他分子(zi)機製參與線粒體生物(wu)學過程。然而，mtAP2蛋白的缺失导致虫體線(xian)粒體内呼吸鏈(lian)复合體III和IV的亚基豐度顯著降低，这一发(fa)現由蛋白(bai)組學結果所證實，反映出该蛋白在呼吸鏈(lian)蛋白質稳定性或組裝中(zhong)的關键角色。同時，mtAP2蛋白缺失引发線粒(li)體形態异常表現(xian)，包(bao)括線粒體肿胀(zhang)、扭曲以及嵴数目的减少，这些超微結構的改變直接影響(xiang)了(le)線粒體的能量代谢功能，导(dao)致其功能明顯下降。此外，回补實驗進(jin)一步明(ming)確了mtAP2蛋白的功能(neng)屬性：野生型mtAP2蛋白能够(gou)有效恢复敲低株(zhu)的生长缺陷，而缺乏AP2結構域(yu)的突變(bian)體則无法恢复这一缺陷表型。
如圖2所示，四個mtAP2蛋白在弓形虫(chong)細胞内的作用機製並非傳統意義上的轉錄因子，而是對維持虫體線粒體的形態結(jie)構和正常生理(li)功能发挥了至
通過IP-MS技術平臺對蛋白質相互作(zuo)用進行深(shen)度分析，研究人(ren)員发現了mtAP2蛋白與線粒體核糖體蛋白之間的特异性結合關系(xi)。實驗結果顯(xian)示，mtAP2-1與小亚基(ji)（mt-SSU）蛋白實現特异結合，而mtAP2-2、mtAP2-3和mtAP2-4則分(fen)別與大亚基（mt-LSU）蛋白表現特异性結合模式。在后續進行的交聯實驗中(zhong)進一步表明(ming)，当MgCl2存在的情况下，所有mtAP2蛋白均能與大小亚基蛋白產生相互作用，这一(yi)結果確認了(le)它們作為線粒體核糖體重要組分的身份。采用蔗糖梯度分离技術進行的(de)構象稳定性分(fen)析表明，mtAP2蛋白對維持線粒(li)體核糖體亚基(ji)的結構完整性发挥着至關重要的作用，当任一(yi)mtAP2蛋白发(fa)生(sheng)缺失時，均會导致虫體線粒體核糖體亚基組裝體出現(xian)解(jie)體現象。同時，通過RIP-seq技術的高通(tong)量測序手段鉴定出43個小(xiao)RNA片段的(de)存在，其中17個屬於mt-SSU相關(guan)序列，26個屬於mt-LSU相關(guan)序列，並在分析過程中发現了7個新(xin)的小RNA片段。綜合以上各項實(shi)驗数據(ju)，这些(xie)結果充分表明，mtAP2蛋(dan)白作為線粒體核(he)糖體的核心組分，在(zai)維持線粒體核糖體完整性和正常功能方面具有不可替代(dai)的重要作用。
圖3 四個mtAP2蛋白為(wei)虫體線粒體核糖(tang)體的構成蛋白
為了深入了解四個mtAP2蛋白在整個線粒體(ti)核糖體中的分子位置和功能分布特征(zheng)，研究團隊通過大(da)規模培养剛地弓形虫速殖(zhi)子，並采用蔗糖梯度分离純化和冷(leng)冻電镜(jing)技術對其進行高分辨率結構解析。經過详細的数據處理和(he)結(jie)構重建，結果顯示單独LSU的分辨率達到2.89Å，而(er)處於成熟線粒體(ti)核糖體中的SSU头部、SSU主體和LSU三個(ge)部(bu)分的分辨率分別為3.6Å、3.29Å和3.11Å，这樣的分辨(bian)率水平足以觀察到原(yuan)子級別的細節結構。在形(xing)態學特征上，研究发現SSU比LSU更大，呈現该物種所特有的延长椭(tuo)圆形头部結(jie)構，这種独特的(de)形態適應了剛地弓形虫特殊的寄生生活方式。同時，大小(xiao)亚基中均含有大量顶复門原虫所特有(you)的核糖體蛋白，这些蛋白質成分的特异性分布直接反映了该寄生虫線粒體核糖體(ti)的進化特點(dian)。SSU包含兩個富(fu)含蛋白質(zhi)的區域，呈(cheng)現擴展平臺和極短的h44區域結構特(te)征，其中A位點高度保守，說明(ming)其在(zai)翻译功能中的關键作用。研(yan)究還发現，剛地弓形虫線粒(li)體核(he)糖體大亚基的中央突起（CP）部分完全由蛋白構(gou)成，内(nei)部並不含有5S rRNA，这與(yu)真核生物核(he)糖體的典型結構差异顯著。值得注(zhu)意的是(shi)，弓形虫線粒體核糖(tang)體蛋白(bai)数目高達132個，其中近半数為顶(ding)复門原虫所特有蛋白，这個数量远高於多数真核(he)生物的線粒體核糖體(ti)。相比之下，真核生物的(de)線粒體(ti)核糖體通常含有2-3条線粒(li)體核糖體RNA，而(er)弓(gong)形虫的線粒體核糖體RNA呈現高度碎片化(hua)，片段总数竟然高達40条以上(shang)，这(zhe)種極端的RNA分裂模式在真核生物中極為(wei)罕见。同時(shi)部分(fen)rRNA片(pian)段結構独特(te)，在細菌核糖體rRNA中未找(zhao)到對應片段，表明剛地弓形虫的線粒(li)體核糖體經历了独特的(de)進化過程。
圖4 籍(ji)借單顆粒冷冻電(dian)镜技術首次解析了弓形虫線粒體核糖體的高分辨率三維結構
圖5 弓形虫線粒體核糖體(ti)的蛋白構成及其呈高度片(pian)段化的線粒體核糖體rRNA片段
研究者通過(guo)對剛地(di)弓形虫線粒體核糖體的深入結構分析，確定了四個mtAP2蛋白在这一關键翻译場所中(zhong)的精確三維位置及(ji)其與多個線粒體rRNA片段之間的具體相互作用機(ji)製。其中mtAP2-1蛋白定位於虫體線粒體核糖體小亚基(ji)的头與體连接處(chu)这一特殊的結構枢纽位置，主要與SSUB和SSUD兩個rRNA片段发生相互作用(yong)；mtAP2-2蛋白(bai)則位(wei)於大亚基的CP區域，與RNA11和LSUA兩個rRNA片段相互(hu)作用；mtAP2-3蛋白位於新生成肽鏈通道出口的外侧上方这一(yi)蛋(dan)白質合成的關键區域，與RNA13、RNA29和RNA38三個rRNA片段相互(hu)作用；mtAP2-4蛋白位於肽基轉移(yi)酶中心(xin)PTC下方的(de)亚基内侧區域，與LSUA和RNA3片段相互(hu)作用。这些蛋白分(fen)子通過與rRNA片段的3'末端和5'末(mo)端等關键位點相結合，在線粒(li)體核糖體的成熟過程中對(dui)rRNA片段的正確組裝起到了關键性的(de)調控作用。除(chu)此之外(wai)，剛地弓形虫(chong)線粒體核糖體中還富含(han)RAP和HPR兩個(ge)蛋白家族(zu)的RNA結合蛋白，这些RNA結合蛋白主要分布位置在線粒(li)體核(he)糖體分子的外围區域。这一系列发現表明(ming)，mtAP2蛋白家族不(bu)仅在維持核糖體整體結構完整性方面发挥着重(zhong)要作用，還可能參與調節和协調大小兩個亚基的(de)相互(hu)結合過程。
圖6 四個mtAP2蛋白(bai)與線粒體核糖(tang)體rRNA片段相結合
本研究首次系統揭示(shi)了顶复門原虫線粒體核糖體的独特三維結構特征和分子組裝機製(zhi)，详細描述了高度碎(sui)片化的線粒體rRNA通過AP2家族轉錄因子的(de)演化路径，阐明了四個mtAP2蛋白如何與诸多(duo)其他線粒體核糖(tang)體蛋白（mtRPs）形成(cheng)精密的蛋白質相互作用網絡，协同組裝成功能(neng)完備的蛋(dan)白翻译機器，維持寄生虫細胞的能(neng)量代谢需求。本研究通過結構生(sheng)物學和分子生物學(xue)相結合的方法，為線粒體核糖(tang)體的組(zu)裝機製、進化適應性以及寄(ji)生虫與宿主的相(xiang)互识別提供了新的理解維度。研究的突(tu)破性結果不仅填补了線粒體核糖體领域的關键科(ke)學空白，還(hai)通過揭示顶(ding)复門原虫特有的蛋白翻译裝置，為针對多種由顶复門原(yuan)虫引发的寄(ji)生虫疾病（包括弓形虫病和疟疾(ji)）的新型治疗策略開发(fa)奠定了重(zhong)要的分子生物學基礎。通過靶向線粒體核糖體的(de)關键(jian)功能蛋白，未來有望(wang)開发出更高效、更特异的小分子药物或生物製剂，為全(quan)球弓形虫病和疟疾的防治與控製事(shi)業带來新的科學希望。
